Il progetto iniziale fu dell'architetto ducale Biagio Rossetti, nume tutelare dell'architettura ferrarese del Rinascimento.
Il cantiere del palazzo vide all'opera alcuni illustri scalpellini e pittori della corte estense dell'inizio del XVI sec.: fra i primi Gabriele Frisoni, Girolamo Pasino e Cristoforo di Ambrogio, fra gli altri Benvenuto Tisi detto il Garofalo, Ludovico Mazzolino e l'Ortolano.

Biagio Rossetti iniziò la costruzione dell'edificio nel 1500 e nel 1503 la lasciò alle cure di Girolamo Pasini e Cristoforo di Ambrogio da Milano. Tuttavia nel 1504 essa venne definitivamente abbandonata e l'edificio rimase incompiuto.

Fulcro del palazzo è il cortile d'onore, completato solo su due lati e ornato da un doppio loggiato dalla ricca decorazione scultorea in pietra bianca, probabilmente opera di Gabriele Frisoni.
Dello stesso è la scalinata di accesso al piano nobile, con alzate dei gradini decorate con motivi geometrici, delfini e palmette.
Le finestre del piano nobile, originariamente alternativamente aperte e cieche, creano un gioco di pieni e vuoti che ancora si può in parte apprezzare sulla facciata del palazzo su via Porta d'Amore. Il loggiato del lato meridionale del cortile d'onore prospetta su un vasto giardino.
All'incompiuto palazzo non manca la decorazione di una parte degli interni. Sono notevoli le volte lunettate di tre stanze al pianterreno, affrescate, secondo l'opinione predominante, da Benvenuto Tisi detto il Garofalo (1481-1559) e dai suoi allievi. Nelle due sale sotto l'ala di levante, dette rispettivamente Sala delle storie di Giuseppe (dalle scene a chiaroscuro inserite tra una decorazione fitomorfa stilizzata su fondo turchino) e Sala delle Sibille e dei Profeti (anche questa per le figure rappresentate, in gran parte policrome) la fattura talora scadente fa pensare più agli allievi che al Maestro.
Di tutt'altro tenore è la terza sala affrescata, detta Aula Costabiliana o Sala del Tesoro, posta presso il portico meridionale e i cui affreschi sono concordemente attribuiti al Garofalo. Di forma rettangolare, è fregiata in alto da 18 lunette a chiaroscuro con scene riferibili al mito di Eros e Anteros, o dei due Amori. Così le descrive il soprintendente Carlo Calzecchi Onesti in un suo libro del 1936 sul Palazzo di Ludovico il Moro: scene «di un mito dei due Amori, che attende ancora chi lo commenti: prima che il secondo Amore nasca in solitudine selvaggia, è consultata una Dea cui si chiede: DIC DEA, QUA NATUS RATIONE ADOLESCERE POSSIT. La Dea dà il responso: EST RURSUS PARIENDUS AMOR. Il secondo Amore è svegliato dalle Grazie: più tardi i due Amori, riuniti, hanno da Vulcano le ali, cavalcano cicogne, ecc.»
Nella volta, con audace prospettiva da sotto in su, sono raffigurate scene della vita di corte, di evidente ispirazione mantegnesca (la Camera degli Sposi nella reggia mantovana): da un'ampia balconata rettangolare, tra festoni di fronde, si affacciano una trentina di personaggi assorti in lieti conversari e muniti di strumenti musicali. Al rosso dei tappeti anatolici da preghiera (tra i primi di questo tipo conosciuti in Europa) che pendono dalla balconata, fa riscontro il verde dei festoni che si collegano sopra la lieta comitiva, sullo sfondo del cielo. La prospettiva aerea è continuata, al centro, da una fascia dodecagona con inserti monocromi di ispirazione classica che sale a forma di cupola fino a un grande rosone in legno dorato, certo inclusovi in epoca posteriore.

Proprietari diversi si succedono dalla fine del XVI secolo in poi, frazionando e modificando l'impianto e riducendo infine la struttura in uno stato di grave degrado. È Direttore Generale alle Antichità e Belle Arti Corrado Ricci quando si definisce, nel 1920, l'esproprio del Palazzo, acquistato dal Demanio dello Stato per 195mila lire. Nel 1930 il Ministero decide che il palazzo diventi sede del materiale archeologico proveniente dalla necropoli di Spina; i lavori, resi possibili grazie ad uno stanziamento ministeriale di un milione, terminano alcuni anni dopo e il 20 ottobre 1935 viene inaugurato il Museo Archeologico Nazionale.
Tra i caratteri di questa splendida residenza rinascimentale risultano dominanti il colore dei materiali impiegati, l'armonia delle forme, l'accogliente ed ampia corte che, tramite il porticato, si apre sul giardino, gli squisiti ornamenti dello scalone, la fuga di sale e lo spazioso corridoio al piano nobile, i soffitti lignei e i cicli di affreschi che decorano tre delle sale del piano terreno.
Il Museo Archeologico Nazionale conserva ed espone le testimonianze archeologiche ritrovate nella provincia di Ferrara, prime tra tutte quelle di Spina che, tra il VI e il III sec. a.C., rappresentò uno dei centri focali della regione.